有多种不同的技术可用于颗粒大小分析,特别是对悬浮在流体中的颗粒。在这里,我们讨论用于测量直径在10 nm-10μm范围内的颗粒的方法,并将spectradyne使用微流阻式脉冲传感的nCS1TM与其他商业技术进行比较。相比之下,病毒颗粒通常在50 nm或以上;细胞外小泡,包括外小体,直径从几十纳米到几微米;红细胞直径6-8μm,白细胞,如中性粒细胞直径10-12μm;人头发直径约100μm。比这更大的颗粒最容易用光学显微镜来研究,这里不作讨论。
可用的方法包括:
微流控电阻脉冲传感(MRPS)是 电阻脉冲传感 或RPS。主要区别在于,RPS中的分析室被一次性微流控药筒所取代,其中不同的药筒型号设计为具有不同尺寸的孔径,允许分析更大范围的颗粒尺寸。这意味着为粒度分析选择的药筒可以针对样品中预期的粒度进行优化。
Spectradyne nCS1TM和 ARCTM 采用使用一次性微流控盒的微流控电阻脉冲传感。通过使用最先进的微流控制造技术,我们将传统RPS中使用的关键粒子传感收缩缩小了约100倍,从几十微米直径缩小到几百纳米。这使我们能够使用MRP检测比使用RPS可能更小的颗粒。微流控盒的示意图如下所示。微流控盒包括一个3μm;L分析物储液罐、板载过滤器、分析物偏压端口、传感电极、流体电阻器和临界MRPS孔径或纳米缩颈,粒子一次流过其中一个。分析物可以是血清、稀释的或全浓度磷酸盐缓冲盐水或任何导电液体,通过偏压电极进行偏压,使电流流过分析物、流体电阻器和孔径。当悬浮在分析物中的颗粒流过孔径时,它通过阻断部分电流来改变收缩电阻,其量与纳米颗粒体积与孔径体积之比成比例,就像在RPS中一样。因此,单个粒子的感应电压变化与其体积成比例,从而允许对其进行计数和大小调整。Spectradyne微流控盒中的孔径小得多,可以检测到更小的颗粒。
一次性MRPS墨盒包括电压偏置端口 Va 和 Vb, 微流控纳米缩孔 Ra 和一个流体电阻器 Rb, 电压偏置导致电流 I 为了流动,设置电压 Vout 感应电极的。流经孔径的粒子会在时间上改变孔径电阻(右上角),从而导致感应电压发生可测量的变化 Vout. 这些变化与粒子体积成比例,因此每个粒子的体积都是单独测量的.
您可以在我们的网站上的其他地方阅读更多关于微流控电阻脉冲传感的信息:
Spectradyne MRPS技术核心的微流控墨盒。
Spectradyne nCS1TM, 它使用微流控盒进行测量。
几乎所有的生物纳米颗粒样本都包含许多不同颗粒类型的异质种群。Spectradyne的ARC可以使用MRPS测量整个分布的大小和浓度,同时仅测量和显示样品中最多三个不同荧光通道中的荧光阳性颗粒。
上面的图表说明了MRPS和荧光表型的结合是如何在Spetradyne的ARC仪器中实现的。流经微流体盒中心纳米收缩的纳米颗粒通过MRPS测量,使用电信号;同时,激光照射纳米颗粒,任何荧光信号通过仪器光学装置收集和分析;记录强度和荧光波长,并与MRPS分析的测量信号相结合,提供组合数据,例如能够识别纳米颗粒和确定纳米颗粒的大小。
Spectradyne's ARCTM,结合荧光表型和MRPS
电阻脉冲传感(RPS)是世界范围内用于量化全血分析中红细胞和白细胞计数的粒度分析方法,也称为库尔特计数。该方法依赖于对颗粒大小的电感应。样品体积由一个不透水的膜分为两侧,膜上有一个小开口。体积的两侧充满弱导电流体(例如盐水或其他生物相容溶液);体积的一侧也有待分析的颗粒。在孔径上施加一个小的压差,使流体和悬浮在其中的颗粒通过孔径。同时在孔径上施加电压偏置,使小电流通过孔径。当没有粒子通过孔径时,电流有一个值;当粒子通过孔径时,它会改变电流可以流过的体积,因此孔径的电阻会增加。电流相应地减少,减少的量与粒子的体积成严格比例。
因此,RPS是一种单粒子方法:通过孔径的每个粒子瞬时改变电流的量与粒子体积成比例,时间与粒子速度成反比,因此与流体流速成反比。通过计算颗粒数和测量流速,可以非常准确地确定颗粒浓度;通过将粒子通过时的体积合并,可以计算粒子数量随粒子体积变化的定量分析。
这些数据构成由RPS执行的粒度分析的基本输出:颗粒浓度与颗粒大小。由于每个粒子都是单独感测的,因此对于检测到的信号如何与每个粒子的数量或大小相关没有任何假设:测量是直接的。RPS仪器是台式仪器,样品制备最少。可使用RPS分析的颗粒尺寸范围取决于孔径大小和用于检测颗粒的电子器件的灵敏度;通常,动态范围(就粒径而言)约为1μm;m高达100亩;m、 在标准RPS中,包含流体的两个体积以及连接它们的孔径是仪器的永久部分,通常不是一次性的;因此,允许一些样品交叉污染。然而,在我们下面讨论的微流控RPS(MPRPS)中,仪器的中央颗粒分析部分被一次性微流控盒取代,消除了这一潜在误差源。
流体中的颗粒通过缩颈(NC),如上图左侧所示。在NC的两侧连续施加电压。当粒子通过NC时,输出信号随粒子体积成比例变化。颗粒单独测量,不依赖于颗粒材料。
使用RPS仪器进行粒度分析可获得的典型数据,具有从单颗粒测量中累积的定量垂直轴和水平轴,具有良好的粒度分辨率。
动态光散射(DLS)是一种测量大量粒子的技术(它不是单个粒子对单个粒子的技术)。激光用于照亮悬浮颗粒的流体样品,激光散射颗粒。由于激光发出的光是相干的,因此来自不同粒子的散射光会发生干涉,并产生光和暗区域的投影图案(称为散斑图案)。位于激光轴一侧的光电探测器用于捕捉和监测该散斑图案的时间依赖性,其中软件根据这些数据生成散射光自相关函数。通过分析自相关函数的时间依赖性,特别是光相关中衰减的时间依赖性,可以使用布朗运动物理学推断粒子的大小。
这一分析背后的数学是复杂的,为了得出最终结果,我们进行了许多假设,如果样品是单分散的,这一假设效果最好,这意味着样品中只有一种尺寸的颗粒;如果样品是不同粒径的混合物,则效果要差得多。问题的一部分是大粒子比小粒子散射更多的光;散射光的量按直径的六次方进行缩放,因此直径为两倍的粒子散射64倍的光,因此在样品分析中占主导地位。如果样品的粒子浓度较低,分布式激光系统也能发挥最佳作用,因此激光在到达探测器之前平均只散射一次粒子。
DLS只需要很少的样品制备,并且该仪器是一种台式工具。然而,解释测量结果揭示的样本信息充满了不确定性,可能会产生误导。通常情况下,对于样品中粒径的实际分布,先验知识知之甚少 正交法 风险很高。
读 在这里 了解DLS与Spectradyne的MRPS技术的比较。
这 申请说明 将告诉您DLS测量中的假峰值。
激光散斑图案。
纳米粒子跟踪分析(NTA)与 动态光散射 或DLS;它本质上是它的单粒子表亲。在一个特殊的样品架中填充悬浮颗粒的流体样品,激光以掠入射照射样品。从粒子上散射的光由显微镜物镜收集,并投影到成像电子器件上,如CCD。每个粒子在CCD上形成一个图像,并跟踪每个粒子的运动作为时间的函数。随机布朗运动是从图像的时间序列中提取的,从布朗运动的物理学中,粒子的直径(称为水动力直径) 可以计算, 如果 已知样品的粘度。
该方法简单,样品制备量小。这适用于尺寸范围约为100 nm至1μm的颗粒;m(1000 nm);直径小于约100 nm的粒子散射的光明显较少(散射光量随直径的增大而增大 D 到第六次方),因此,较小的颗粒往往无法检测到,而大于1μm的颗粒;m的移动量不够(布朗运动太小),无法从图像中提取其直径。单个样本产生的信息量有限,因为同一时间最多只能监测几百个颗粒;需要进行多次连续测量,以获得足够的统计数据,从而可靠地报告颗粒浓度与粒径的关系。样品架是非一次性的,每次使用后必须清洁,以防止样品交叉污染。
NTA方法遇到了一个奇怪的问题,俗称为 假峰值 问题当粒子对小粒子的灵敏度下降为直径的六次方时,NTA将报告一个分布,该分布在某个直径以下,从而产生一个 假峰值 在分发中。使用 正交法 可以揭示该假峰,强烈建议用于了解实际尺寸分布很重要的测量。
了解有关纳米粒子跟踪分析的更多信息.
NTA的测量设置图。
电子显微镜,特别是透射电子显微镜和扫描电子显微镜(TEM和SEM)是 金本位制 用于粒度分析。为了制备用于电子显微镜的样品,从含有颗粒的几毫升液体中干燥样品。在某些情况下,样品涂上纳米厚的导电碳或金层,以防止观察样品时产生杂散电荷。然后将干涂层样品放置在显微镜的样品分析室中;虽然更昂贵的现代显微镜允许在空气中进行样品检查,但最常见的情况是在真空中进行。然后用阴极产生的高能电子束照亮样品;电子的能量范围从几千伏到几百千伏,并通过同轴磁铁聚焦到直径为0.1到1纳米的焦点。在扫描电镜中,该焦点在样品上扫描,而在透射电镜中,光束穿过样品,散射发生在穿过内部的过程中,之后散射的电子在CCD上成像。散射电子或在某些情况下由束中初级电子产生的次级电子或两者都被收集并投影到成像系统中。通过这种方式可以形成非常高分辨率的颗粒图像,并使用使用校准标准在显微镜上校准的精密测量工具进行分析。在透射电镜中,晶体材料可以对构成样品的原子成像。
颗粒直径可以非常精确地测量,每个颗粒的几何细节都可以在图像中显示出来。通过形成许多图像并使用自动化软件,可以计算颗粒的尺寸分布,并计算浓度与颗粒直径的关系。
样品制备和样品成像以及图像分析非常耗时。TEM和在较小程度上SEM是大型、充满房间的设备,需要具有低振动、低杂散磁场和良好温度控制的特殊空间。在成本和时间方面,将此方法用作常规样本测量技术显然是不可取的。这些数据通常用作此处讨论的其他一些技术的正交验证。
扫描电子显微镜拍摄的典型纳米颗粒图像 (SEM).
现场分馏技术使用所谓的“现场”分离悬浮在流体样品中的颗粒,在现场的作用下,不同的颗粒以不同的速率移动。用于分离的字段取决于特定仪器;它可以是重力场、离心场、热梯度、磁力等等。
场流分馏(FFF)提供了最著名的场分馏方法。含有待分析颗粒的流体流经长通道,其侧面由半透膜形成。温和的垂直流体流经这些膜,导致沿通道移动的颗粒缓慢漂移,其中较大的颗粒在这种横流中的移动速度略快于较小的颗粒,因为它们的流体动力学半径较大,因此阻力系数较大。因此,在通道的输出处,存在穿过通道宽度的粒度梯度,并且通常使用光学成像方法检测该梯度,该方法测量穿过通道宽度的不同直径的相对浓度。这不是一种逐个粒子的方法,因为它测量的是整体响应。定量浓度测量很困难,但可以提取颗粒数与流体动力学半径的比例信息。
该方法只需少量样品制备,仪器为台式仪器。由于分析体积不是一次性的,因此可能会发生样品交叉污染。它不是一种单粒子方法,因此受到通常挑战,产生比绝对粒径和浓度更成比例的信息。它适用于各种粒径,粒径差小至10%即可分离;。然而,它可能会被主通道中的抛物线Poiseuille流模式所混淆,在主通道中,边界附近的颗粒流动更慢,并且可以积聚在分离流的下游侧,而在相反的上游侧,颗粒穿过中心附近的较高流速,因此与从通道中心开始的颗粒分离的量不同。
场流分馏分拣机的操作示意图。
圆盘离心是另一种现场分馏技术。场分离使用所谓的“场”分离悬浮在流体样品中的颗粒,在场的作用下,不同的颗粒以不同的速率移动。用于分离的字段取决于特定仪器;它可以是重力场、离心场、热梯度、磁力等等。
在圆盘离心中,样品放置在旋转的充液圆盘的中心,然后以高旋转速度(通常为10000-25000 rpm)绕其轴旋转,沿圆盘平面产生一个有效的引力场,比地球引力场大数百或数千倍。如果样品中的颗粒密度高于圆盘中的流体密度,则由于离心力和流体浮力的平衡,它将在该场的方向上感受到净力。然后,它将以由净力和流体摩擦力的平衡决定的速度移动,后者随流体粘度和粒子的流体动力学半径而缩放。因此,密度相同但直径不同的粒子集合将在时间上分离,因为它们的终点速度(或迁移率)与其直径成反比。当粒子在磁盘中扩散到一定直径时,它们会通过激光束,并遮挡传输到磁盘另一侧探测器的光。遮蔽程度与粒子的光密度(粒子散射强度和粒子数密度的组合)成正比,透射光强度随时间的变化允许推断粒子大小分布。
在圆盘离心中,样品放置在旋转的充液圆盘的中心,然后以高旋转速度(通常为10000-25000 rpm)绕其轴旋转,沿圆盘平面产生一个有效的引力场,比地球引力场大数百或数千倍。如果样品中的颗粒密度高于圆盘中的流体密度,则由于离心力和流体浮力的平衡,它将在该场的方向上感受到净力。然后,它将以由净力和流体摩擦力的平衡决定的速度移动,后者随流体粘度和粒子的流体动力学半径而缩放。因此,密度相同但直径不同的粒子集合将在时间上分离,因为它们的终点速度(或迁移率)与其直径成反比。当粒子在磁盘中扩散到一定直径时,它们会通过激光束,并遮挡传输到磁盘另一侧探测器的光。遮蔽程度与粒子的光密度(粒子散射强度和粒子数密度的组合)成正比,透射光强度随时间的变化允许推断粒子大小分布。
盘式离心颗粒分析仪示意图。
Spectradyne制定了财务利益冲突政策 这里.